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Mise en évidence des repliements imparfaits des macromolécules vectorisées par l’étude des variations de compressibilité.

Doctorant : Donato VALDEZ PEREZ

Directeur de thèse : Wladimir URBACH

Sujet : Mise en évidence des repliements imparfaits des macromolécules vectorisées par l’étude des variations de compressibilité.

Etablissement : Université PARIS V

Date de soutenance : DECEMBRE 2001

Résumé :

Les systèmes biologiques ont un besoin primordial d’eau. Simple lubrifiant moléculaire dans certains cas, l’eau le plus souvent impliqué dans des interactions beaucoup plus complexes. En effet, les interactions des molécules d’eau avec les groupes fonctionnels des peptides et des protéines jouent un rôle crucial dans leurs stabilités, leurs dynamiques et dans les rapports essentiels entre la structure et la fonction. Ces mécanismes impliquent aussi les diverses étapes du repliement des protéines et de leurs dénaturations, leurs interactions avec des ligands (médicaments) ou encore avec les membranes biologiques (récepteurs). Le problème fondamental est de mesurer exactement la quantité d’eau nécessaire et suffisante à ces effets.

Nous avons utilisé un système biomimétique simple : une solution de nanogouttelettes d’eau entourées par une couche monomoléculaire et dispersées dans un solvant organique : les micelles inverses. Ainsi nous avons pu étudier la conformation et les propriétés physico-chimiques de protéines dans des conditions expérimentales nettement plus satisfaisantes que les solutions aqueuses ou les mélanges de solvants organiques habituellement utilisés pour les protéines membranaires.

La détermination de la compressibilité adiabatique d’une inclusion dans un milieu donné exige la mesure de la vélocité ultrasonore mais également des déterminations densimétriques de haute précision.

L’appareillage spécifique, étudié et construit au laboratoire, permet déterminer la célérité de l’onde ultrasonore dans des volumes de l’ordre du cm3. Notre choix s’est orienté sur une méthode utilisant des signaux impulsionnels et basée sur la mesure de temps de vol de l’onde retenue de l’onde ultrasonore entre le transducteur émetteur et le transducteur récepteur. Nous améliorions la méthode en utilisant un calcul qui intègre tout le signal plutôt qu’une estimation ponctuelle. Ce calcul détermine le centre de gravité énergétique des impulsions émise et reçue.

Le dispositif expérimental, unique en France, est constitué de deux cellules de mesures identiques, usinées dans le même bloc d’acier inoxydable, et thermiquement stabilisées par circulation d’eau (25 ± 0.01 °C). L’une des cellules est remplie avec le solvant (qui sert de liquide de référence) et l’autre contient le même solvant avec des inclusions. La différence de célérité de l’onde ultrasonore entre les deux cellules représente l’écart de vitesse induite par l’introduction d’inclusions dans le solvant. L’ensemble est placé dans une pièce à température contrôlée. Ces choix minimisent l’influence des fluctuations de température sur la mesure de la célérité. Cette méthode est automatisée et convient à des milieux faiblement atténuants. De plus, elle est facile à mettre en œuvre.

Une étude théorique mais surtout expérimentale nous a permis de choisir les différents paramètres électriques : la fréquence de l’onde ultrasonore, la durée de l’émission, le rapport cyclique du signal d’émission, l’amplitude de l’onde émise... Un protocole expérimental a été développé : nombre de moyennage des signaux, durée entre 2 mesures différentes... La précision relative sur la vitesse est de l’ordre de 10-5. Les masses volumiques des solutions étudiées sont déterminées à l’aide d’un appareil commercial (Anton Paar DMA 58) avec une précision relative de 10^-5. La compressibilité d’une solution est déduite avec une précision relative meilleure que 2.10^-3, et la compressibilité des objets dispersés dans la solution avec une précision meilleure que 1 %. Ces résultats sont suffisants pour nos applications.

Ces mesures de vitesse et de masse volumique associées à différentes techniques expérimentales : Rayons X, RMN (résonance magnétique nucléaire), nous ont permis de caractériser notre système biomimétique de membranes biologiques.

Nos résultats ont été interprétés à l’aide du milieu effectif. Nous avons montré que ce modèle est valable pour des inclusions de masse volumique proche de celle du solvant, pour des dimensions des inclusions faibles devant la longueur d’onde, et pour des fractions volumiques des objets dispersés inférieures à 10 %. L’utilisation du modèle nous a permis de caractériser les micelles inverses, d’étudier des protéines encapsulées dans ces micelles.

Les résultats ont été obtenus et interprétés premièrement pour le système biomimétique de membranes biologiques, puis deuxièmement pour des protéines basiques ou non-basique, membranaire et globulaire, au contact de ce modèle de membrane.

1. le systèmede micelles inverses, Notre dispositif expérimental permet :

* d’utiliser une mesure ultrasonore différentielle pour accéder à la valeur de la compressibilité adiabatique d’une solution micellaire avec une précision de l’ordre 1 %, * de mesurer la variation de la tension superficielle du film monomoléculaire entourant les nanogouttelettes d’eau dispersées dans le solvant organique, * de déterminer le nombre de molécules formant le film monomoléculaire * de déduire le volume des molécules d’eau liées au film.

2. les protéines encapsulées dans les micelles inverses, Nous avons également :

* déterminé la compressibilité de différentes protéines en fonction du taux d’hydratation, et montré que la compressibilité diminue avec le taux d’hydratation. Seule la protéine membranaire présente une compressibilité indépendante du taux d’hydratation. Nous avons interprété ce résultat en admettant que la protéine était en interaction forte avec les têtes polaires de surfactant, avec expulsion d’eau interfacial. * dorme une estimation de la compressibilité intrinsèque (intérieur de la protéine non accessible à l’eau) des protéines, ce qui n’avait jamais pu être déterminée expérimentalement auparavant, et montré que cette compressibilité est de grandeur voisine pour toutes les protéines étudiées (quelque soit leur taille, ou leur charge électrique). Ces résultats sont en accord avec les prévisions théoriques.

Finalement nous avons montré que les mesures de la compressibilité permettent de suivre les modifications de structures tridimensionnelles des protéines. Pour la protéine p-lactoglobuline, la compressibilité dépend uniquement de l’hydratation (pas de changement structure). Pour la MBP (protéine basique de la myéline) la compressibilité dans les micelles est constante quelque soit l’hydratation (pas de changement de structure, protéine repliée et restant en contact avec la membrane). La compressibilité de la MBP est différente dans l’eau (protéine dépliée). Pour les 2 autres protéines basiques (cytochrome c et Iysozyme) la compressibilité dépend de l’hydratation sans atteindre la valeur obtenue dans l’eau. Elle dépend de la structure tridimensionnelle de la protéine.

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